周梦晗试验数据，苦荞中黄酮对血糖的影响-食安荟
周梦晗试验数据，苦荞中黄酮对血糖的影响-食安荟
周梦晗苦荞黄酮降血糖功能评价实验总结
实验结果为：各类苦荞黄酮溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用大小顺序为：苦荞总黄酮溶液＞苦荞水溶性黄酮溶液＞苦荞醇溶性黄酮溶液＞阿卡波糖。实验证明苦荞黄铜降血糖功能明显。
以下食实验具体数据：
1、原料与试剂
α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶，pNPG（4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷）（日本wako公司提供）；拜糖平（每片含阿卡波糖50mg）（德国拜耳公司）；
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钠、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、苯酚、氢氧化钠、亚硫酸钠、可溶性淀粉等均为分析纯。
2、仪器与设备
AR2130电子天平：奥豪斯AdverturerTM；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；DSY-1-4型电热恒温水浴锅：北京爱琦霞商贸中心；UV-1100型紫外-可见光分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。
3、试剂配置
0.1mol/L的磷酸钾缓冲液：准确称取8.7g磷酸氢二钾，6.8g磷酸二氢钾，分别加少量重蒸馏水溶解，并定容至500mL，混合两种溶液，调pH至6.8，备用（注意避光冷藏存放）；
α-葡萄糖苷酶酶液：α-葡萄糖苷酶溶于0.1mol/L的磷酸钾缓冲液（pH6.8）中，配成0.1U/mL溶液备用（注意避光冷藏存放）；
pNPG溶液：pNPG溶于0.1mol/L的磷酸钾缓冲液（pH6.8），配成2mmol/L的溶液备用（注意避光冷藏存放）；
α-淀粉酶酶液：将α-淀粉酶溶于0.1mol/L的磷酸钾缓冲液（pH6.8），配成0.1U/mL溶液备用（注意避光冷藏存放）；
1%淀粉溶液：将1g可溶性淀粉溶于磷酸钾缓冲液（pH6.8），煮沸，冷却后定容至100mL，冷却备用（注意避光冷藏存放）；
DNS溶液：3.15g3，5-二硝基水杨酸溶解于131mL2mol/LNaOH溶液中，再将此溶液与250mL含有91g酒石酸钾钠的热水混合，向该溶液中再加入2.5g苯酚与2.5g亚硫酸钠，充分搅拌使之溶解，待溶液冷却后，用水稀释定容到500mL容量瓶，储存于棕色试剂瓶中（冰箱内放置一周后使用，注意避光冷藏存放）；
阿卡波糖溶液：称取一定量的拜糖平药剂（每片含阿卡波糖50mg），用少量重蒸馏水溶解，配成一定浓度的溶液备用；
苦荞总黄酮溶液：在传统提取方法确定的最佳条件下提取苦荞麸皮，提取后所得的溶液即为苦荞总黄酮溶液，加一定量重蒸水稀释，配成不同浓度的溶液；
苦荞水溶性黄酮溶液：在传统提取方法确定的最佳条件下提取苦荞麸皮，将提取后所得的溶液回收乙醇，将回收后余下的溶液静置，过滤，所得滤液即为苦荞水溶性黄酮溶液，加一定量重蒸水稀释，配成不同浓度的溶液；
苦荞醇溶性黄酮溶液：在传统提取方法确定的最佳条件下提取苦荞麸皮，将提取后所得的溶液回收乙醇，将回收后余下的溶液静置，过滤，并不断用重蒸水洗涤滤渣，所得滤渣即为苦荞醇溶性黄酮，将苦荞醇溶性黄酮用60%的醇溶液溶解，加一定量重蒸水稀释，配成不同浓度的溶液。
4、实验原理及方法
4.1 实验原理
（1）试验对象：苦荞黄酮总黄酮溶液、苦荞水溶性黄酮溶液、苦荞醇溶性黄酮溶液。
（2）试验项目：①对α-葡萄糖苷酶的体外活性抑制作用；②对α-淀粉酶的体外活性抑制作用。
（3）结果判定：对α-葡萄糖苷酶或α-淀粉酶抑制成阳性，则可判定其辅助降糖功能。对α-葡萄糖苷酶或α-淀粉酶的抑制作用优于阳性对照物，则可判定其强效辅助降血糖功能，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用均次于阳性对照物，则判定其弱效辅助降弱效降血糖功能。
4.2 实验方法
4.2.1 α-葡萄糖苷酶活力测定
参照Matsui等方法略作改进，以pNP-G为底物测定α-葡萄糖苷酶的活性。将α-葡萄糖苷酶 (0.1U/mL，0.6mL) 在37℃水浴中孵育10min后加入底物pNP-G（2mmol/L，0.1mL）以启动反应。体系于37℃反应20min后，加入1mL 0.5mol/L Na2C03终止反应。最后于405nm处测定在酶作用下从pNP-G中释放出的对硝基苯的吸光度值，计算抑制率。酶抑制试验重复3次，每次3个复管。
4.2.2 α-葡萄糖苷酶的抑制作用测定
参照上述方法，在反应体系中加入不同浓度的抑制剂溶液1mL，阳性对照为拜糖平，空白对照为不加抑制剂（以蒸馏水补足），其他与抑制剂管操作相同。背景对照为对应浓度的抑制剂溶液，不加酶液（以蒸馏水补足），其他与抑制剂管操作相同，其反应体系如表1所示。反应终止后用蒸馏水稀释定容到10mL，于405nm处测其吸光值。
表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制体系表酶液抑制剂pNPG碳酸钠空白管0.6mL—0.1mL1.0mL空白对照管——0.1mL1.0mL抑制剂管0.6mL1mL0.1mL1.0mL背景对照管—1mL0.1mL1.0mL
抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：
抑制率（%）＝（1 – A00 / A01）× 100
A00=A3-A4，A01=A1-A2
式中 A1、A2、A3、A4分别为405nm处空白管、空白对照管、抑制剂管和背景对照的吸光值。
4.2.3 α-淀粉酶活力测定
α-淀粉酶水解淀粉为还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖反应显示出红棕色，540nm处比色，定量测定α-淀粉酶的活性。参照DNS（3,5-二硝基水杨酸）比色法，反应体系：0.3mL α-淀粉酶37℃预热5min，加入0.4mL 1%的淀粉溶液在37℃下反应5min；加入0.2mL DNS，沸水浴5min后，取出冷却，定容至25mL，540nm下测定吸光值。
4.2.4 α-淀粉酶抑制作用测定
参照上述方法，在反应体系中加入不同浓度的抑制剂溶液1mL，阳性对照为拜糖平（拜糖平），空白对照为不加抑制剂（以蒸馏水补足），其他与抑制剂管操作相同。背景对照为对应浓度的抑制剂溶液，不加酶液（以蒸馏水补足），其他与抑制剂管操作相同，其反应体系如表2所示。反应终止后用蒸馏水稀释定容到25mL，于波长540nm处测其吸光值。
表2 α-淀粉酶活性抑制体系表酶液(mL)抑制剂(mL)淀粉溶液(mL)DNS(mL)空白管0.3—0.40.5空白对照管——0.40.5抑制管0.310.40.5背景对照管—10.40.5
抑制剂对α-淀粉酶的抑制率：
抑制率（%）＝（1 – A00 / A01）× 100
A00=A3-A4，A01=A1-A2
式中 A1、A2、A3、A4分别为540nm处空白管、空白对照管、抑制剂管和背景对照管的吸光值。
5、实验结果与分析
5.1 对α-淀粉酶活性抑制曲线
通过测定不同浓度的抑制剂对α-淀粉酶活性的抑制率，如表 3所示。
表3不同浓度溶液对α-淀粉酶的抑制率苦荞总黄酮溶液（mg/mL)抑制率（%）苦荞水溶性黄酮溶液（mg/mL）抑制率（%）苦荞醇溶性黄酮溶液（mg/mL）抑制率（%）阿卡波糖浓度（mg/mL)抑制率（%）0.00755.990.0047.430.025.020.00066.710.01513.070.01216.220.048.910.00313.000.0325.070.0222.30.0613.610.00621.030.04530.30.0430.640.0825.40.00925.230.0639.110.0637.910.1232.840.0341.200.0951.420.0843.550.1640.890.0652.310.1260.760.1151.610.248.460.0966.660.1566.780.1565.320.2454.150.11882.400.1870.790.276.620.2861.760.14892.690.2473.490.2887.910.3166.51
以苦荞总黄酮浓度（mg/mL）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图1所示。
由图1可以看出，在浓度为0~0.12mg/mL区间内，苦荞总黄酮对α-淀粉酶活性的抑制呈较明显的剂量依赖关系，随剂量的加大，抑制率增大。当苦荞总黄酮溶液浓度大于0.12mg/mL以后，增长趋势逐渐变得平缓。当苦荞总黄酮溶液浓度达到0.238mg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率可以达到73.49%。以苦荞水溶性黄酮浓度（mg/mL）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图1所示。
由图2可以看出，在浓度为0~0.15mg/mL区间内，苦荞水溶性黄酮对α-淀粉酶活性的抑制呈较明显的剂量依赖关系，随剂量的加大，抑制率增大。当苦荞水溶性黄酮溶液浓度大于0.15mg/mL以后，增长趋势逐渐变得缓慢。当苦荞水溶性黄酮溶液浓度达到0.282mg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率可以高达87.91%。
由图3可以看出，在浓度为0~0.35mg/mL区间内，苦荞醇溶性黄酮对α-淀粉酶活性的抑制呈剂量依赖关系，随剂量的加大，抑制率增大。当苦荞醇溶性黄酮溶液浓度达到0.313mg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率达到66.51%。
以阿卡波糖浓度（mg/mL）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图4所示。
图4 阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制曲线
由图4可以看出，在浓度为0~0.25mg/mL区间内，阿卡波糖对α-淀粉酶活性的抑制呈剂量依赖关系，随剂量的加大，抑制率增大。当阿卡波糖溶液浓度达到0.25mg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率达到92.69%。
5.2 α-淀粉酶的半抑制浓度
通过测定不同苦荞黄酮溶液对α-淀粉酶的半抑制浓度IC50，与临床上已经应用的药物α-淀粉酶酶抑制剂阿卡波糖对α-淀粉酶的半抑制浓度作比较，IC50越小，表明抑制效果越好；IC50越大，表明抑制效果越差。
由图1 ~4得出原料对α-淀粉酶的半抑制浓度IC50如表4所示。
表4 原料对α-淀粉酶的半抑制浓度(IC50)
图3 苦荞总黄酮对α-淀粉酶的抑制曲线以苦荞醇溶性黄酮浓度（mg/mL）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图3所示。阿卡波糖苦荞总黄酮苦荞水溶性黄酮苦荞醇溶性黄酮IC50 mg/mL0.090.0860.1080.200
由上表可以看出，各类苦荞黄酮溶液对α-淀粉酶的抑制作用大小顺序为：苦荞总黄酮溶液＞阿卡波糖＞苦荞水溶性黄酮溶液＞苦荞醇溶性黄酮溶液。
5.2 对α-葡萄糖苷酶活性抑制曲线
通过测定不同浓度的抑制剂对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，如表 3所示。
表3不同浓度溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制率苦荞总黄酮溶液（mg/mL)抑制率（%）苦荞水溶性黄酮溶液（mg/mL）抑制率（%）苦荞醇溶性黄酮溶液（mg/mL）抑制率（%）阿卡波糖浓度（mg/mL)抑制率（%）0.003511.780.0027.590.00557.380.036.080.00719.600.00415.570.01116.3050.0612.370.01429.310.00823.420.02225.3350.1525.270.02140.20.01631.580.03332.960.333.870.02850.380.02442.230.04440.0450.4545.530.03561.760.03255.950.05548.270.656.810.04272.570.0465.4450.06657.5650.7563.210.05680.370.04873.810.07766.000.972.000.0787.150.05683.090.08873.2251.0581.870.08493.010.06490.350.09978.9051.290.36
以苦荞总黄酮浓度（mg/mL）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图5所示。
图5 苦荞总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线
由图5可以看出，在浓度为0~0.04mg/mL区间内，苦荞总黄酮对α-葡萄糖苷酶活性的抑制呈较明显的剂量依赖关系，随剂量的加大，抑制率增大。当苦荞总黄酮溶液浓度大于0.04mg/mL以后，增长趋势逐渐变得平缓。当苦荞总黄酮溶液浓度达到0.084mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率可以达到93.01%。
以苦荞水溶性黄酮浓度（mg/mL）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图6所示。
图6 苦荞总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线
由图6可以看出，在浓度为0~0.07mg/mL区间内，苦荞水溶性黄酮对α-葡萄糖苷酶活性的抑制呈较明显的剂量依赖关系，随剂量的加大，抑制率增大。当苦荞水溶性黄酮溶液浓度达到0.064mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率可以高达90.35%。
以苦荞醇溶性黄酮浓度（mg/mL）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图7所示。
图7 苦荞总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线
由图7可以看出，在浓度为0~0.1mg/mL区间内，苦荞醇溶性黄酮对α-淀粉酶活性的抑制呈剂量依赖关系，随剂量的加大，抑制率增大。当苦荞醇溶性黄酮溶液浓度达到0.099mg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率达到66.51%。
以阿卡波糖浓度（mg/mL）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图8所示。
图8 苦荞总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线
由图8可以看出，在浓度为0~0.25mg/mL区间内，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制呈剂量依赖关系，随剂量的加大，抑制率增大。当阿卡波糖溶液浓度达到0.25mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到78.91%。
5.2 α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度
通过测定不同苦荞黄酮溶液对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50，与临床上已经应用的药物α-淀粉酶酶抑制剂阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度作比较，IC50越小，表明抑制效果越好；IC50越大，表明抑制效果越差。
由图5~8得出原料对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50如表5所示。
表5 原料对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC50)阿卡波糖苦荞总黄酮苦荞水溶性黄酮苦荞醇溶性黄酮IC50 mg/mL0.850.0260.0370.057
由上表可以看出，各类苦荞黄酮溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用大小顺序为：苦荞总黄酮溶液＞苦荞水溶性黄酮溶液＞苦荞醇溶性黄酮溶液＞阿卡波糖。