周梦晗试剂盒，让RNA制备变得快速和容易-生物论荐
周梦晗试剂盒，让RNA制备变得快速和容易-生物论荐
周梦晗
RNA的制备历来是一项繁琐、有毒和棘手的工作，涉及酚/氯仿相分离和醇沉。现在有很多更容易的方法来为下游应用提供RNA准备，如测序和反转录，这些技术很快被实验室新手所掌握。尽管有机提取物仍然被认为是金标准，但是不同的试剂盒和对该操作的改进使得这一过程更加常规，也没以前那么令人恐惧。
我们看看现代实验室使用的试剂盒、试剂和程序，使从组织提取RNA变得高效。
预备
RNA是不稳定的，重要的是它得尽可能的像准备程序一开始那样保持完整。如果组织在收集后不立即使用，请确保采取措施保持其完整性。首选的方法是速冻在液氮中。如果这不可取，把样品放入保护液中，如RNAlater，且要切成足够小的块，如果太大的一块，将无法保持RNA完整。
从组织中释放RNA的过程可能需要不同的程序。有些，像血液或细胞系，可以简单地被溶解，而其他可能需要用手术刀切碎，用超声或用玻璃珠匀浆。
无论使用试剂盒或自制的方法，大多数分离发生在变性剂中如离液盐，洗涤剂或酚，它们能抑制核酸酶。
RNA纯化一般遵循几种常用方法（有时是方法的混合或组合）。最常见的是有机抽提，在这里，亲水性RNA与样品的其他成分如DNA和蛋白质分离。纯化柱和磁珠可以用来捕获RNA到固体表面。而且，虽然不是严格意义上的“纯化”，直接溶解（通常放进含有DNA酶的缓冲液中）后可直接用于下游的一些粗放的实验，也可进一步纯化。
TRIzol
异硫氰酸胍-酚试剂和试剂盒的配方以多种商品名出售，但通常被称为TRIzol?-已成为制备RNA的有机萃取剂的选择。TRIzol法可以直接添加到组织或细胞。一旦细胞匀浆，加入氯仿，溶液混合离心，促进两相分离。上层是水相，含有RNA可以将进入一个清洁管，留下DNA（在交界面）和蛋白质（在有机相）。
“如果你用TRIzol你几乎得到只有RNA，”Lamb说，她依赖这标准提取试剂。“而且很便宜，”她补充道。
“它很好用，但是如果你有大量样品需要准备的话，那将真的痛苦，”CarolKreader说，milliporesigma的研发研究员。“这是酚氯仿萃取，你必须清除危险废物。”
Zymo研发的Direct-zol?RNA试剂盒提取允许样品在Trizol被纯化柱处理。“这比你做两相分离快很多，并给出了类似的结果，”Zymo的研究助理Ryan Sasada说。
纯化柱
William Fulton，约翰霍普金斯医学院小儿外科实验室高级经理，用Trizol从培养的3D组织中提取RNA，“因为它有助于更好地解决这一切。”
另外，他的实验室主要使用Qiagen的硅基纯化RNEasy纯化柱提取试剂盒。在适当的缓冲液条件”结合-洗涤-洗脱“硅（或玻璃纤维，或离子交换膜将有选择性地绑定RNA）。“我们使用的试剂盒，因为它让实验室的科学家们使用起来更容易—Trizol是很臭的东西，”他说。如今有很多类似的试剂盒，但他们坚持用RNeasy为了历史数据的比较，富尔顿说。使用连续吸液管，输送量主要受离心机容量的限制。
纯化柱会被样品中的颗粒物质堵塞，并且只有有限的结合能力。大型核酸如基因组DNA可随着RNA保留，因此一些研究人员将样品加DNA酶上柱或者后纯化。
Lexogen分裂RNA提取试剂盒采用锁相凝胶有助于保持阶段单独执行酚-氯仿法提取。所得到的水相再在石英柱上进一步纯化。调整酒精量会使恢复偏向长或总RNA。
磁珠
由于其基于溶液动力学，磁性粒子能非常有效的捕捉RNA。各种各样的表面化学物质可用于靶向基因，或一组特定的RNA。RNA可以被小体积洗脱，并以寡核苷酸（dT）捕获探针为引物在磁珠上进行反转录。“这是一个很好的方式去做它如果你有很多要做，特别是如果你的标本量很少，Kreader指出。
她补充说：“珠子的优点在于它们具有可扩展性，但它们通常价格更高。”
裂解
组织细胞可通过直接裂解在缓冲液里，这些缓冲液可以破坏细胞膜和稳定裂解产物。因为结合和洗脱不是过程的一部分，回收的样品可以避免其他方法固有的一些偏差。但由于产物不纯净，浓度不能直接用分光光度法检测。
Arcis生物技术公司最近推出了两管，三分钟样本制备试剂盒，用洗涤剂在脂质双层里打孔，释放核苷酸进入裂解缓冲液。“所有的核酸聚集在一起，稳定而不能被核酸酶降解。Andrew Birney解释道，分销这个试剂盒的Cole-Parmer公司全球生命科学产品经理。RNA将在室温下保持稳定六天。“当你将等分的裂解缓冲液放入洗涤液中，所有的核酸排列成行，成为线性的。“这个试剂盒产生的总核酸；没有区分DNA和RNA。
杂记
许多实验步骤和试剂盒将产生RNA的整个谱，从小型的miRNA到碱基长的mRNA。但是要小心。“有很多[硅基]试剂盒历史上称为“总RNA”抽提试剂盒的，你用它将失去的大部分小于200个碱基的RNA”，Kreader警告。她建议用Trizol或碳化硅基试剂盒来提取小RNA。
大多数操作流程和试剂盒是为大量的细胞设计的，但现在有几种试剂盒能够从单个细胞中提纯RNA。
在大多数情况下，上述方法的RNA足够好，足够纯净，用于下一代测序，而不必清除任何DNA污染。但反转录（或低丰度RNA测序），建议使用DNA酶。而且为了更好的效果，最好设计跨越拼接接头的引物。
Lamb临别的话：“如果你在实验室使用一个试剂盒，它可以工作，就不要做任何改变。”
原文来自
Josh P. Roberts
Posted: November 28, 2017
生物论荐编译
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